肺泡上皮糖萼的结构及其在ARDS过程中的应用

翻译北京市公共卫生临床中心全麻科俞立奇 #

摘要：肺脏上皮糖萼是一层由糖胺糖苷（GAG）和蛋白糖苷组成的致密阴离子层，排列在肺脏上皮的表面。肺部皮糖萼在心脏稳态和脓毒症脏器功能障碍中具备公认的作用，而肺脏上皮糖萼则鲜为人知。近来的临床前研究阐明，上皮糖萼在多种大鼠急性喘气拮据综合征（ARDS）模型中降解，非常是这些由吸入性外伤（何谓的“直接”肺挫伤）造成的模型，致使GAG断裂到肺脏气腔间隙中。上皮糖萼降解也发生在喘气亢进的人身上，通过剖析从喘气机热湿交换（HME）过滤器荣获的二氧化碳来量化。在ARDS病患中，GAG断裂与缺氧血症的严重程度相关，并可预测喘气亢进的持续时间。这种作用或许是由表面活性物质功能障碍介导的，由于大鼠上皮糖萼的靶点降解足以造成肺脏表面张力降低、弥漫性微扩张和肺迎合性损毁。在这篇述评中，我们描述了肺脏上皮糖萼的结构及其在ARDS过程中降解的制度。我们还回顾了现今关于上皮糖萼降解在肺挫伤发病体系中的可归因作用的知识。最后，我们将糖萼降解作为ARDS异质性的潜在介质，随即对GAG断裂的床旁监护量化的价值，以潜在地确定这些病人最有或许对从而减小糖萼降解的抗生素形成反应。

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介绍

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急性喘气拮据综合征（ARDS）是一种灾难性的危急症，每年影响台湾多名病人，与严重的发病率相关，死亡率为30-35%。这些复杂综合征的特点是肺心脏漏水、表面活性物质功能障碍、肺迎合性损毁和缺氧性喘气亢进。 #

不幸的是，虽然进行了几三年的临床前研究，但ARDS的临床实验在巨大程度上难以确定缓解病人预后的抗生素治愈办法。有希望的临床前数据难以转换为成功的临床实验，这越来越多地归因于ARDS中存在的实质性异质性。为此，随机研究一般忽视了将治愈分配与造成病人肺挫伤的模式相匹配。有效的ARDS治愈方式的开发和个性化推行既须要了解这种不同的肺挫伤模式，也须要辨识才能确定ARDS病人外伤主要驱动诱因的生物标识物。 #

ARDS发病模式的一个潜在靶点模式是肺脏上皮糖萼的降解，这是一个由糖胺糖苷（GAG）、蛋白甾醇和肺脏表面糖蛋白组成的网状层。在肺挫伤的植物模型中（如ARDS病人），上皮糖饿降解，将GAG花絮断裂到肺脏空气中。在人类中，这些断裂的程度是高度异质的，一些ARDS病人几乎没有上皮糖萼降解的证据。因此，其他ARDS病人表现出大量的肺脏内GAG断裂，这可以预测机械通气的持续时间和入院时间延长。GAG断裂可以在床头轻松迅速地辨识，使用非入侵性搜集的空气空间流体样本的床旁剖析。这些测试能否迅速辨识肺挫伤的潜在靶点模式（何谓的“可治愈特性”），并或许促使ARDS个性化医治策略的推行。

在这篇述评中，我们将描述肺脏上皮糖萼的结构。之后，我们回顾了关于肺挫伤过程中上皮糖萼降解模式的现有文献以及糖萼降解对ARDS发病模式的可归因影响。最后，我们探求了肺脏腔GAG断裂作为ARDS中一种新的、潜在的归因生物标识物在床旁监护量化的潜在作用，这或许会辨识接受从而避免上皮糖萼降解或推动其再生的抗生素最有或许获益的病人。 #

肺脏上皮糖萼结构

自从20世纪60年代的通过电子显微镜研究以来，肺脏上皮中连续层的存在早已得到了注重。和Gil教授的某些基础研究强调，存在一层浅表乳液，目前已知由肺表面活性物质组成，覆盖在肺脏低相（an）或假定其由粘黄酮（即GAG）和蛋白质组成的“致密基底层”上。在原始解剖学描述后来，对表面活性物质的结构和功能进行了几三年的深入研究，现在已知表面活性物质具备关键的生物化学和免疫调节功能。相比之下，肺脏低相（an），目前被觉得是肺脏上皮糖萼，研究不足。新出现的研究阐明2023肺泡表面活性物质，肺脏上皮糖萼是上皮表面的关键部份，其降解有助于解释多种不同脑部外伤后的肺挫伤发病模式。肺脏上皮糖萼，与背部其他内皮和上皮细胞的糖萼一样，主要由长的无官能团GAG组成，这种GAG通过跨膜或糖基磷脂酰肌醇-蛋白糖苷锚定在肺脏表层细胞膜上。构成该结构的主要GAG物种是硝酸甲基地塞米松（HS，一种由N-甲基葡糖胺和己糖醛酸的重复单元组成的线性花青素，葡糖醛酸或其差向异构体，碘酸）、硫酸骨膜素（CS，一种线性黄酮由N-甲基半乳糖胺和己糖醛酸的重复单元构成），和透明质酸（HA，一种由N-乙酸酐甲基半乳糖和樱桃糖醛酸组成的无盐酸盐线性甾醇）（图1）。 #

HS和CS是通过一系列复杂的方法在高尔晶粒的蛋白质侧链上合成的，包括链聚合（由外泌体-1和-2介导）、硫酸化和（由磺基转移酶如N介导-脱乙酸酐酶/N-磺基转移酶-1和-2）和差向异构酶。很多氯化化GAG链连结的蛋白胺基，包括HS蛋白黄酮（HSPG）或CS蛋白花青素，如多官能团糖苷，被转运到细胞表面，在那儿他们产生糖萼。即便踏入细胞外，糖盏HS或许会通过细胞外硝酸酯酶如sulf-1和-2进行额外的修饰；HS硼酸化的这些合成后控制阐明糖萼硼酸化稳态的重要性。事实上，HS和CS在特定位点的硼酸化赋于这种分子负电势的物理结构域，容许静电结合到同源的带正电势的蛋白质残基。GAG结合改变蛋白质功能，使GAG才能调节下游细胞讯号传导。与HS和CS相比，HA是非硝酸盐的，不与蛋白糖苷结合。HA由透明质酸合成酶合成，透明质酸合酶是具备多个跨膜结构域的酶，坐落细胞膜内表面。在合成过程中，生长的HA聚合物通过膜挤出到细胞外空间，于是在那儿通过与HA合成酶或细胞表面配体如CD44结合而锚定在细胞表面。细胞外HA还与其他GAG产生复合物，进而提高糖萼的结构稳定性。这些网状阴离子层共同支持手臂内皮细胞和上皮细胞的许多稳态功能。Ochs及其朋友在一篇出众的述评中提供了上皮糖萼结构的具体示意图。

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图1:肺脏上皮糖萼的结构。上皮糖萼是排列在上皮表面的糖胺糖苷（GAG）层。硝酸甲基地塞米松（HS）是一种线性花青素，由葡糖胺和己糖醛酸（葡糖胺或其差向异构体，碘酸）的重复单元组成。硝酸骨膜素（CS）是一种线性花青素，由甲基半乳糖和己糖醛酸的重复单元组成。HS和CS都是连结到蛋白黄酮侧链上，而且可以在特定的位点被盐酸化，如图所示。透明质酸（HA）是一种线性花青素，由甲基半乳糖和樱桃糖醛酸组成。它与CD44结合，使得不与上皮表面的蛋白黄酮共价连结，使得不被氯化化。硝酸甲基地塞米松（HS）、硫酸骨膜素（CS）、透明质酸（HA）、N-乙基葡糖胺（）、N-酰甲基半乳糖胺（），樱桃糖醛酸（GlcA）、糖醛酸（IdoA）、半乳糖酰基（Gal）、木糖（木酮糖）、分化抗体簇44（CD44）。

肺脏上皮糖盏降解的模式

近期的研究阐明，肺脏上皮糖萼在多种家兔肺挫伤模型中降解，这阐明它或许在ARDS的发病模式中发挥重要作用。及其男友发觉，在食道内予以脂寡糖（LPS）后，包括HS和CS在内的GAG会踏入大鼠的肺脏腔，但不会踏入循环。这种结果得到了体外试验的支持，在体外试验中LPS诱导培养的A549上皮细胞中HS断裂。有趣的事，这种发觉并非LPS独有，由于在博来霉素诱导的肺挫伤大鼠模型中，HS也会流入支食道肺脏灌洗剂中，其中观察到完整全长的和高度硼酸化的HS在最初外伤后在肺脏腔中持续3周。之外，鼠疫传染后也会发生类似的上皮糖萼降解，这会诱导GAG向肺脏腔大量和长时间断裂。与在这种模型中观察到的肺脏腔大量GAG断裂产生对比，这种模型的特点是初始上皮外伤（何谓的“直接”肺挫伤），我们几乎没有观察到肛门带环和穿刺（CLP）后肺内上皮糖萼降解的证据，该模型主要以肺部皮功能障碍（何谓的“间接”肺挫伤）为特性（图2）。其实，这种试验室发觉阐明，直接方式的肺挫伤诱导上皮糖萼降解，对肺部皮糖萼的影响最小。相反，间接方式的肺挫伤诱导明显的内皮糖萼降解，对上皮糖萼的外伤最小。对重症患者的观察性研究支持了直接与间接肺挫伤中糖萼降解的差别。 #

与糖萼断裂的这些差别一致，驱动内皮和上皮糖萼降解的模式是不同的。在肺炎相关的内皮糖萼降解中，GAG的断裂是由甲基地塞米松酶（一种HS特异性樱桃糖醛酸酶）的激活介导的，甲基地塞米松蛋白酶直接降解HS并向血清中释放小的八糖片断。这与直接肺挫伤相关的肺脏上皮糖萼降解产生对比，在此过程中断裂的GAG基本上是完整的（厚度>20个花青素）使得高度硼酸化。肺脏间隙中全长GAG的存在阐明，上皮糖萼降解是由切割将GAG锚定在上皮表面的蛋白糖苷的酶介导的，而不是樱桃糖醛酸酶（如甲基地塞米松酶）或其他糖苷靶点酶直接将GAG切割成小花絮。事实上，大鼠食道内博来霉素后甲基地塞米松酶的诱导性欠缺对博来霉素后持续的肺脏腔内GAG断裂没有影响。类似的，甲基地塞米松酶成份的欠缺并不能阻挡食道内LPS后肺的严重挫伤。值得留意的是，这种结果与Li及其朋友的研究结果相矛盾，Li及其朋友报告称，甲基地塞米松酶的毒理学抑止减小了LPS诱导的A549细胞和大鼠LPS诱导的肺挫伤的密切连结外伤。之外，虽然已发表的文献中大部份都集中在HS断裂的制度上，但值得留意的是，CS和HA在肺挫伤其间也会断裂到肺脏腔中。CS断裂也或许是多官能团糖苷断裂的结果，多官能团糖苷或许具备CS配体。或则，CS和HA的断裂也或许是多功能蛋白糖苷（富含通过核心蛋白与HA互相作用的大CS-蛋白甾醇）断裂的结果。 #

近期的研究指出，在直接肺挫伤其间，上皮糖萼的降解或许是由多种冗余蛋白酶介导的。诸如，LPS和博来霉素都诱导基质金属蛋白酶（MMPs）的抒发，MMPs是能否分馏蛋白糖苷（如-1）的蛋白酶，将GAG锚定在上皮表面。LPS与MMP9和（在较小程度上）MMP2的诱导有关；有趣的是MMP9的基因敲除不会减低上皮糖萼断裂，这或许是因为MMP2的代偿性调低的结果。类似地2023肺泡表面活性物质，博来霉素诱导肺脏MMP2的初期激活，继而诱导MMP9的后期激活。之外，Gill及其朋友的研究阐明，MMP7是一种重要的蛋白酶，可促使-1从上皮糖萼断裂。其实，这种发觉阐明广泛的MMP抑止对于减少直接肺挫伤中糖萼断裂或许是必要的。事实上，多西环素是MMPs和相关蛋白酶的广泛抑止剂，可降低LPS、博来霉素或水痘传染中上皮糖萼断裂和/或肺挫伤的严重程度。其他蛋白酶，如去整合素样金属蛋白酶（ADAMs），也或许有助于肺挫伤其间上皮糖萼降解的程度。和朋友证明，介导-1和-4从上皮细胞表面剥落，以响应病变坏疽因子（TNF）α和甲硝唑（IFN）γ。其实，这项工作阐明，在直接肺挫伤后，一个复杂的系统中，包括MMPs和ADAMs在内的蛋白酶的冗余诱导介导上皮糖萼降解。 #

图2：健康和肺挫伤其间肺的上皮和内皮糖萼。（A）在稳态其间，肺具备肺部皮糖萼和肺脏上皮糖萼。吸入性外伤导致的肺挫伤（“直接肺挫伤”）与肺脏上皮糖萼的降解有关。相反，手臂外伤导致的肺挫伤（“间接肺挫伤”）主要以肺部皮糖萼降解为特点。值得留意的是，急性喘气拮据综合征（ARDS）病人一般同时有多处外伤，这或许造成内皮和上皮糖萼的降解。（B）大鼠的直接脑部外伤（脂甾醇、流感、博来霉素）诱导HS断裂到肺脏液中（支食道肺脏灌洗，经尿素稀释校准）。（C）大鼠间接肺挫伤（CLP）不会诱导HS断裂到肺脏液中。（D）CLP确实诱导HS从内皮糖萼断裂到血清中（每组n>5541只大鼠）*p＜0.05。脂甾醇（LPS）、IT（食道内）、IN（鼻内）、病灶产生单位（FFU）、盲肠带环和穿刺（CLP）。 #

ARDS其间肺脏上皮糖萼降解的后果

上皮屏障功能障碍

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为了确定上皮糖萼降解在肺挫伤中的可归因作用，我们的开发了一种靶点、酶促（真菌地塞米松酶诱导）降解上皮糖盏的大鼠模型。使用该模型，我们观察到靶点上皮糖萼降解足以诱导BAL蛋白浓度的降低。令人惊奇的是，在没有肺脏病变或肺囊肿发展的状况下，肺脏对蛋白质的渗透性降低，这阐明上皮硝酸甲基地塞米松的降解不只是是对肺脏隔膜导致非特异性外伤。有趣的是，这种发觉对HS降解是特异性的，由于骨膜素酶对上皮CS的类似靶点降解不会损害大鼠的上皮屏障功能。虽然上皮糖萼断裂造成上皮屏障功能障碍的准确制度尚不清楚，但及其朋友的研究阐明，细胞膜-1通过推动细胞保护讯号传导来调节对疟疾的反应，进而限制支食道上皮细胞自噬并降低肺挫伤。这种发觉阐明，上皮糖萼降解或许通过提高上皮细胞自噬而损害屏障功能，这可以解释在靶点上皮糖萼退化过程中没有明显增生反应的状况下发觉屏障私密性降低。因此，重要的是要留意，上皮糖萼对屏障完整性的重要性并不局限于肺，由于多个研究早已证明了糖萼对其他上皮界面（包括肾脏和耳朵）屏障功能调节的重要性。

表面活性物质的功能障碍

表面活性剂是由肺脏II型上皮细胞分泌到肺脏间隙的固醇（90%）和蛋白质（10%）的复杂混和物，适于增加气液界面的表面张力，以避免呼气过程中肺脏崩塌。肺脏上皮糖萼介于上皮细胞和表面活性剂之间；因此，上皮糖萼结构可视化方面的技术挑战限制了对这两种结构之间潜在互相作用的研究。我们近期报导，肺脏上皮糖萼的HS靶点降解会损害表面活性物质功能，造成微小的肺不张和肺迎合性损毁。有趣的是，向未重伤的大鼠添加外源性GAG花絮（HS或CS）并没有诱导迎合性失去，这阐明表面活性物质功能障碍是由天然糖萼外伤导致的，而不是肺脏腔中出现的GAG花絮。 #

观察性人体研究支持了这种发觉的临床相关性，其中肺脏腔GAG花絮可以预测喘气亢进的持续时间。之外，患有溶酶体癌症（如IIIA型粘黄酮病）的病人，表现出表面活性物质代谢损坏和肺功能衰退。虽然上皮糖萼支持表面活性物质功能的准确制度现在尚不确定，但我们观察到地塞米松，一种高度硼酸化的HS方式，可以直接与表面活性物质蛋白A、B和D结合。表面活性物质蛋白A和D都属于蛋白质的集合蛋白家族，其含有才能与甾醇结合碳水缩聚物辨识的结构域。我们猜想，完整的上皮糖萼可以将表面活性物质限制在上皮上，确保维持肺脏复张所需的最佳表面活性物质分布。 #

损坏上皮修补

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不仅对脑部生理的某些急性影响外，肺脏上皮糖萼的降解制约了从肺挫伤中恢复。在博来霉素诱导的肺挫伤（一种模型，肺挫伤后会有一段较长的恢复期）其间，HS花絮在最初的外伤后在肺脏腔空间中持续3周。博莱霉素给药后7天开始使用广泛的MMP抑止剂多西环素医治，减低了GAG的持续断裂，缓解了肺功能，这阐明持续的糖额降解或许会妨碍上皮修补过程。虽然很多发觉的准确制度尚不清楚，但及其朋友的研究阐明，-1对肺上皮的迁移和附着很重要，这阐明-1的断裂或许与上皮修补破损有关。之外，及其朋友的研究阐明，-1的断裂通过细胞外水泡调节上皮重编程，影响肺纤维化和肺腺癌的发生，通过调节外泌体miRNA，影响肺挫伤的进展或恢复。之外，考虑到上皮糖萼是屏障功能所必需的，这些延长的GAG断裂或许会延后正常肺脏毛细神经完整性的恢复。最后，断裂的GAG花絮在生物学上只是活性的，才能结合和腐植酸肺修补性生长因子，如成纤维细胞生长因子（FGF）和肝细胞生长因子。

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减缓继发性真菌性肾炎的严重程度

不仅肺脏上皮糖萼降解对肺挫伤和修补的直接影响外，上皮糖萼退化还或许影响寄主-病原虫的互相作用。虽然众所周知，病毒性肝炎使脑部对严重的继发性真菌性肾炎的易感性降低，但发生此类状况的制度尚不完全清楚。近期有报导称，鼠疫外伤了脑部微环境，诱导耐甲氧西林金红色樱桃真菌（MRSA）成孔细胞毒素A/B（LukAB）下调，这将降低继发性MRSA麻疹的严重程度。有趣的是，在鼠疫传染其间断裂的肺脏上皮HS结合并激活LukAB，造成鼠疫后MRSA麻疹的严重程度。对-1在结膜传染中断裂的研究阐明，上皮糖萼断裂或许通过其他模式增进继发性真菌传染，比如促使疟原虫附着到上皮表面的隐蔽纤连蛋白位点或腐植酸寄主保护性阳离子抗微生物肽。

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透明质酸在上皮糖萼中的作用 #

如上所述，HA与HS和CS的不同之处在于，它既不被盐酸化，也不共价结合到上皮表面。考虑到这种结构差别，HA在上皮糖盏中也具备不同的功能也就不足为奇了。与其他GAG一样，上皮HA在多种方式的肺挫伤中断裂，包括溃疡性肺病和肺纤维化，通过透明质酸酶和发炎剌激物的作用，如活性氧。之外，在外伤后，肺形成临时HA糖萼，其可以以环境依赖的方法具备保护和有害作用。诸如，HA形成降低和/或HA清理损毁造成持续的先天病变反应，该反应由HA结合蛋白介导，包括癌症坏疽因子（TNF）剌激的基因6。在这儿，HA的降低造成重链HA复合物的形成，其可以降解为较小的LMW片断，这种花絮可以与细胞激酶（包括CD44、TLR4和TLR2）结合，并影响下游生物效应，包括溃疡和纤维化。之外，近期的研究也阐明，HA的缺失影响家兔疟疾的结局，在此其间，HA与HA结合蛋白间α-抑止剂复合，最终造成持续的增生和肺功能衰退，这些作用可以通过给与外源性透明质酸酶来去除。及其男友近期的研究也指出了上皮HA在发炎性肺疾患中的临床重要性，该研究阐明HA是新冠肝炎病人喘气道分泌物的主要成份。最后，不仅肺挫伤过程中HA断裂的某些病变后果外，HA花絮和相关蛋白，如α间抑止剂，已被证明会影响上皮钠通道的活性，这或许会影响肺脏液消除和ARDS的发病体系。

肺脏上皮糖萼降解作为ARDS异质性的介质

强有力的试验室数据无法转换为有效的ARDS医治，越来越多地归因于这些复杂病症的模式异质性。及其朋友确定了ARDS的两种不同表型，每种表型都或许出现不同（或许相反）的治愈反应。这项工作迸发了对ARDS准确医学方式的兴趣，其中基于生物标识物的迅速辨识造成肺挫伤的特定模式将使个性化的靶点疗法成为或许。上皮糖萼降解或许是造成ARDS病人肺挫伤的一种异质和潜在的靶点模式。有趣的是，ARDS中GAG断裂的异质性取决于外伤特异性诱因（直接与间接）以及意外的病人诱因（如性别）。 #

迅速辨识上皮糖萼降解导致肺挫伤的病人亚组的能力将特别有用，由于这将才能丰富从而确定防治糖萼降解医治疗效的临床实验的预测和/或预后。GAG是一种很有前途的生物标识物，部份成因是其稳定性：他们是不受蛋白酶影响，使得对冻融循环具备持久性。虽然具备多重反应检测的质谱是GAG定量的金标准，但这些步骤费用昂贵，而且依赖于高水平的技术专业知识。我们的团队近期优化了一种简略而实惠（每位样本2欧元）的GAG比色测量法（二苯基亚甲蓝），该法在血液（反映排便的循环GAG，因而反映内皮糖萼降解）和HME液（反映肺脏上皮糖萼降解）。这些测试或许有助于确定亚组的病人，这种病人最有或许获益于从而避免GAG断裂的治愈策略，如MMP抑止剂或MMP阻断单克隆抗原。

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推论

肺脏上皮糖萼是一种复杂且研究不足的结构，对肺稳态和肺挫伤发病模式都具备重要性。在外伤过程中，多种发炎剌激激活MMPs和其他（或许是多余的）蛋白酶，分馏才能将糖萼锚定在上皮表面的HSPG和CSPG。上皮糖萼的随即断裂具备重要的后果，对于肺挫伤的发生和发展至关重要，包括肺脏高渗透性、表面活性物质功能破坏、细菌毒力降低和上皮细胞修补破损。还要进行额外的观察性研究，以更好地了解上皮糖萼降解对肺挫伤异质性的影响，因而有或许使上皮糖萼成为ARDS准确医学方式中的治愈靶向。 #